Aquí os dejo una pequeña "Guia Práctica de Manejo en el Laboratorio" con unas pequeñas observaciones, consejos y advertencias para que cada uno que quiera empezar en el mundo del cultivo de levaduras no acabe con las cejas "chamuscás" o algo peor... 

 

bunsen-burn-2 2653562Esterilización y contaminación. Desinfectantes y antisépticos.

(Conceptos generales)

El concepto de esterilización implica la eliminación de todas las formas vivas. Según dicha definición, estéril significa libre de organismos. Otras metodologías, como desinfección, pasteurización, etc., conllevan una eliminación parcial de los microorganismos existentes, pero no de las formas de resistencia.

Métodos de esterilización:

  1. Agentes físicos.
    1. Calor.
      1. Calor seco: flameado, aire caliente (horno)
      2. Calor húmedo: vapor saturado (autoclave/olla a presión). En el autoclave, la esterilización se produce mediante vapor de agua a presión. Se alcanza una temperatura de 121ºC a una sobrepresión de 1 atmósfera.
    2. Filtración: permite la eliminación de los microorganismos de un medio líquido, sin la destrucción del medio. Para ello se hace pasar la muestra líquida a través de un filtro de membrana con tamaño de poro inferior al tamaño de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microrganismos quedarán retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtración estará estéril.
  2. Agentes químicos y radiaciones, de poca utilidad en nuestro caso, debido a la dificultad de aplicación.

Otros métodos de eliminación, si bien parcial, de microorganismos:

- Por calor: ebullición, pasteurización.

- Por agentes químicos, como desinfectantes y antisépticos

El laboratorio de levadura

     Lo primero a tener en cuenta es que lo que hay aquí recogido esta sacado de un par de manuales de prácticas de microbiología, donde te "inculcan" la necesidad de trabajar en un ambiente estéril, y de seguir con una gran escrupulosidad las medidas y recomendaciones para trabajar en un laboratorio.
Lo digo porque, por ejemplo, en algunos laboratorios ni se usan mecheros ni nada y la verdad no se contaminan "demasiadas" cosas, siempre que trabajes de manera limpia y ordenada.

     Básicamente el texto es el de los manuales que podéis encontrar en internet, he cambiado algunas palabras, y omitido algunos apartados, porque creo que no eran necesarios y tampoco hay que volverse majara para trabajar con la obsesión de la esterilidad, sino más bien adaptarse y aprender el manejo del material de la manera que cada uno crea más conveniente.

     Luego los comentarios, o mi modo de ver los procedimientos están entre paréntesis, para cosas puntuales; o en estas "cajitas" estas que me recuerdan a los libros de texto de la escuela. Tampoco es necesario usar todos y cada uno de los materiales que aquí se citan, aunque haya algunos mas interesantes que otros, cada uno debe juzgar que le interesa seguir y que no.

     Aun así, hay algunas recomendaciones muy buenas, en los manuales, a tener en cuenta a la hora de trabajar, y más si queréis aseguraros de que no vais a perder vuestras "pendientes". Algunas son muy obvias, aunque muchas veces no caemos en la cuenta si alguien no nos lo indica.

     Para el manejo en un laboratorio (sea del tipo y la profesionalidad que sea, vamos que lo que tendremos en casa para el cultivo de levaduras, ya es un laboratorio) es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con escrupulosidad:

  • Antes de realizar cualquier proceso, deberían tenerse claro lo que se va a hacer, siempre va bien tener (o hacerse) un “guión” o protocolo, con los pasos detallados en puntos, para tener una idea clara del proceso.
  • El orden y la limpieza son esenciales en todos los procederes en un laboratorio (aunque nadie lo diría al entrar en algunos… jejejeje). En consecuencia, al terminar, se debería proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado y la zona de trabajo y material.

     Y también esta bien limpiar antes de empezar, realizando una desinfección (que no esterilización) de la zona y del material antes de empezar. Para ello puede ser interesante disponer de unas servilletas, o mejor una caja de clínex, y un pulverizador con una solución de alcohol al 70%. Pulverizáis sobre la superficie de trabajo y lo limpiáis con un clínex. Para el material, pulverizáis un clínex y limpiáis el material a usar, como el mango de Kolle. Seria conveniente usar guantes y antes de empezar, rociar una de las manos con el pulverizador y luego os frotáis bien las manos, hasta que el alcohol se evapore. No es imprescindible, pero puede evitaros muchos "disgustos".

     Para hacer una solución de alcohol etílico al 70% podéis usar alcohol de farmacia (etílico al 96%), mezclando 7 partes de este con 2,5 partes de agua (incluso mejor si es agua destilada, ya sea de plancha (siempre que solo sea agua destilada y no lleve mas cosas), de un deshumidificador o aire acondicionado, siempre tendrá menos disueltos que puedan "afectar" la solución).

  • Los productos inflamables (alcohol, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros bunsen o las lámparas de alcohol.

     Esto también se aplica a la hora de pulverizar con la solución de alcohol etílico al 70%, MUCHO CUIDADO CON PULVERIZAR EL ALCOHOL CERCA DE LA LLAMA, encárgate de que el rociado sea en cualquier otra dirección.

  • Cuando no utilices la lámpara, es conveniente que te asegures de haberla apagado y la guardes, evitarás que en un golpe derrames todo el alcohol que hay.
  • Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita.
  • El material de vidrio que uses, si se rompe, conviene que lo deposites en una caja de cartón, o plástico a modo de contenedor.
     Parece una tontería pero al agarrar una bolsa de basura de plástico, puedes hacerte un corte con mucha facilidad.
  • Usar siempre “bata” en el laboratorio (mas que nada es un tema de que te derrames cosas encima, no es necesario…)
  • Es conveniente lavarse las manos con jabón o con un desinfectante, al entrar y antes de dejar el laboratorio.

…algunas precauciones:

  • Se debe trabajar en las proximidades de una llama, así que cuidado los que llevéis el pelo largo.
     Lo mejor es recogerlo, se supone que no vais a estar moviéndoos por ahí. Pero si por cualquier cosa, un ruido o lo que sea, hacéis un giro rápido de cabeza (a lo Pantene-proV) no serias el/la primero/a a quien "veo" quemarse el pelo.
  • Los medios inoculados deben llevar su identificación respectiva. No es buena idea dejarlo para luego, sobre todo si manipuláis más de un tipo de “cepa” (o clase de levadura)

     La situación de los tubos, cambia en el momento más inesperado y sin que os deis cuenta (por motivos aún desconocidos por la ciencia). Incluso es mejor identificar los tubos antes de empezar, llevando cuidado de usar el tubo correcto cada vez.

     Puede ser interesante indicar también la fecha en la que habéis preparado la pendiente y/o en la que la habéis inoculado (si no es la misma) os ayudará a recordar y comprobar fácilmente si ya es hora de pasar a nuevos tubos.

  • Si usáis pipetas volumétricas, estas se cogen de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para regular la caída de pipetalíquido. 

    pipetas

       Hay pipeteadores indicados para el uso de las pipetas volumétricas. Si os interesa el anejo de este material, deberíais plantearos el adquirir un pipeteador, siempre es más higiénico y seguro, sobretodo para la pendiente, que ir haciendo "chupones" con la boca.

  • Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible (inclinados).
  • Para quitar el tapón se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán con la otra que sostendrá a su vez el asa (esto ya depende de la maña de cada uno, yo prefiero destapar con la misma mano del tubo, aunque quizá es mas “peligroso” flamear). Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra, antes de volver a tapar. Lo importante seria no dejar nunca el tapón sobre la mesa.

lo del mechero y tal

   Para mi, la mejor forma de hacerlo seria: i) Esterilizar el asa de cultivo y enfriarla (ver mas abajo); ii) Abrir el tubo con la pendiente a traspasar y flamear la boca; iii) Recoger la pendiente; iv) Vovler a flamear antes de tapar (podeis obviar el flameo al terminar si agarrais toda la pendiente, p.e. para un starter); v) Dejar el tubo y abrir el tubo nuevo a inocular (ya sea una nueva pendiente o un matraz donde hacer el starter, flameando la boca; vi) Inocular, es decir hacer la nueva pendiente o starter; vii) volver a flamear antes de tapar; viii) Tapar; ix) Esterilizar el asa de cultivo.

  • Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la y lo del mechero tamienacción de la llama; también puede flamearse el mango (si vas a introducirlo en el tubo). Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente.

     Aquí podríamos cambiarlo por el hecho de tener siempre algunas pendientes sin inocular, servirían para 2 propósitos:

  1. Asegurarnos que las pendientes que sean de la misma remesa eran totalmente estériles, si no crece ningún organismo en la pendiente que no se ha abierto podéis suponer que las otras, realizadas en el mismo momento, serán igualmente estériles.
  2. Podéis usar una de esas pendientes para "enfriar" el asa de siembra. La ponéis en la llama, luego tocáis con el asa de siembra la pendiente "extra" y oiréis un psssss (quizá hasta podáis oler a mosto requemado) y así os aseguráis que al arrastrar vuestras levas de un lugar a otro no las habéis achicharrado

     Yo lo de flamear el mango, aunque si solo es la punta, pues va a quedar estéril si flameáis como se ve en la imagen. Lo que haría es antes de empezar, darle un buen repaso con alcohol etílico del 70%.

     Otra opción sería el uso de asas de siembra desechables pre-esterilizadas.

 

 

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